Elisa实验：酶联免疫吸附测定类型与操作步骤

Elisa实验：酶联免疫吸附测定类型与操作步骤

ELISA（酶联免疫吸附测定）是将抗原抗体特异性反应与酶的高效催化作用结合的高灵敏度免疫检测技术，目前已广泛应用于医学诊断、生物科研、食品检测等多个领域。365上市公司官网BUNSEN试剂盒

一、ELISA的测定类型

间接法‌

原理‌：先在固相载体上包被已知抗原，加入待检样本中的抗体后，再加入酶标记的二抗进行结合，最终通过显色反应判定结果。

适用场景‌：主要用于检测样本中的特异性抗体，比如HIV抗体筛查、疫苗免疫效价评估等场景。

特点‌：通用性强，一种酶标二抗可适配多种一抗检测，成本较低。

双抗体夹心法‌

原理‌：使用一对配对的捕获抗体和检测抗体，将目标抗原夹在中间形成“抗体~抗原~抗体"的三明治结构，再通过后续显色完成定量。

适用场景‌：适合检测具有2个以上抗原表位的大分子蛋白，比如细胞因子、肿瘤标志物等微量物质。

特点‌：灵敏度高、特异性强，是目前应用的定量检测类型。

竞争法‌

原理‌：样本中的待测抗原和预先标记的已知抗原，竞争性结合固相载体上的有限抗体，最终显色信号越弱代表样本中目标抗原浓度越高。

适用场景‌：专门用于检测小分子抗原或半抗原，比如激素、兽药残留等无法形成双抗体夹心的物质。

直接法‌

原理‌：将酶直接标记在一抗上，直接与包被的抗原结合后显色，操作流程更短。

适用场景‌：多用于重组蛋白活性验证，目前常规检测中使用占比较低。

二、ELISA通用标准操作步骤

包被‌

将捕获抗体或抗原用包被液稀释至1——10μg/mL的工作浓度，每孔加入100μL，4℃过夜孵育12——16小时，或37℃孵育1——2小时，让目标蛋白充分吸附在96孔板表面。

封闭‌

每孔加入200——300μL的封闭液（1%——5% BSA或5%脱脂牛奶），室温孵育1——2小时，封闭固相载体上未结合蛋白的空白位点，避免后续步骤出现非特异性吸附。

加样孵育‌

分别加入梯度浓度的标准品和待测样本，每孔100μL，37℃条件下孵育1——2小时，让样本中的目标分子与包被物充分发生特异性结合。

洗涤‌

倒掉孔内液体，每孔加入300μL PBST洗涤液，静置30秒后甩掉液体并在吸水纸上拍干，重复3——5次，洗去所有未结合的游离物质。

加酶标抗体‌

每孔加入100μL酶标记的检测抗体或二抗，37℃孵育30分钟——1小时，完成结合后再次重复3——5次洗涤操作，去除未结合的酶标抗体。

显色与终止‌

每孔加入100μL TMB底物溶液，室温避光显色15——30分钟，观察最高浓度标准品孔变为深蓝色后，每孔加入50μL 2M硫酸终止液，此时蓝色反应液会变为稳定的黄色。

读数与结果分析‌

加入终止液后的15——30分钟内，使用酶标仪在450nm波长下读取各孔的吸光度（OD值），通过标准品的浓度和对应OD值绘制标准曲线，最终计算出待测样本中目标物质的实际浓度。

三、关键操作注意事项

洗涤操作必须充分，次数不足会导致背景值偏高，洗涤过度则会造成特异性信号减弱，需严格按照试剂盒说明书要求执行。

所有加样步骤必须更换新的吸头，避免样本间交叉污染，试剂从冰箱取出后需恢复至室温再使用，样本禁止反复冻融。

实验必须同步设置阳性对照、阴性对照和空白对照，待测样本建议设置复孔，保证最终结果的准确性。

TMB底物溶液对光敏感，需避光保存和使用，显色过程中需动态观察颜色变化，精准把控终止时机。

注：以上资料仅供参考，不作为实际数据，实验需严格遵循说明或咨询技术老师。

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